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熒光免疫測(cè)定技術(shù)的概念

更新時(shí)間:2019-07-16      點(diǎn)擊次數(shù):2413

1 、熒光免疫測(cè)定技術(shù)的概念:將試劑抗原或試劑抗體用熒光素進(jìn)行標(biāo)記,試劑與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后,測(cè)定復(fù)合物中的熒光素,這種免疫技術(shù),稱(chēng)為免疫熒光素技術(shù)。

2、熒光的產(chǎn)生:

  物質(zhì)吸收外界能量而進(jìn)入激發(fā)狀態(tài),在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以電磁輻射的形式釋放,即發(fā)光,這種光稱(chēng)為熒光。這種物質(zhì),稱(chēng)為熒光素。         

  由光激發(fā)所引起的熒光,為光致熒光

                            ------熒光免疫技術(shù)       

  由化學(xué)反應(yīng)所引起的熒光,為化學(xué)熒光

                            ------化學(xué)發(fā)光技術(shù)

3、熒光素的熒光特性:

⑴ 停止供能,熒光現(xiàn)象隨即終止

⑵ 對(duì)光的吸收和熒光的發(fā)射具高度選擇性,綠色熒光選藍(lán)色為激發(fā)光,紅色熒光選綠色為激發(fā)光

      入射光波長(zhǎng)<發(fā)射光波長(zhǎng)

⑶ 熒光效率:           發(fā)射熒光的光量子數(shù)

          熒光效率=----------------------------

                            吸收光的光量子數(shù)

⑷ 熒光猝滅現(xiàn)象:熒光素的輻射能力減弱

常見(jiàn)熒光素的特性:

  ⑴ FITC:黃色結(jié)晶粉末,吸收光(藍(lán)色激發(fā)光):490~495nm,

          發(fā)射光:520~530nm,明亮的黃綠色熒光。

4、熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn):一般為四級(jí),即“—”無(wú)或可見(jiàn)微弱自發(fā)熒光。“+”僅能見(jiàn)明確可見(jiàn)的熒光。“++”可見(jiàn)有明亮的熒光。“+++”可見(jiàn)耀眼的熒光。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上,而各種對(duì)照顯示為(±)或(-),即可判定為陽(yáng)性。

 

5、普通熒光顯微鏡的操作指南

(1)關(guān)閉房間內(nèi)的電燈,開(kāi)啟顯微鏡汞燈。為延長(zhǎng)汞燈的使用壽命,汞燈開(kāi)啟不到15-30分鐘的請(qǐng)?jiān)?5-30分鐘后關(guān)閉汞燈。再次打開(kāi)汞燈電源的間隔時(shí)間也應(yīng)該在15-30分鐘以上,避免反復(fù)開(kāi)關(guān)。

(2)根據(jù)樣品熒光素選擇相應(yīng)熒光組件。使用減光片對(duì)熒光強(qiáng)度適當(dāng)調(diào)整(因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度不可調(diào),所以只能使用各種減光片來(lái)調(diào)整觀察效果)

(3)選擇濾光片。常用的有綠、藍(lán)、紫、紫外等,分別對(duì)應(yīng)不同的激發(fā)光波長(zhǎng)。

(4)放好染色切片,找到合適的視野。在熒光狀態(tài)下觀察標(biāo)本,標(biāo)本內(nèi)的熒光會(huì)較快的衰減,所以要避免長(zhǎng)時(shí)間的在熒光下觀察,可以先在明場(chǎng)下調(diào)整好要觀察的位置再使用熒光。

(5)需拍照先確認(rèn)照相機(jī)已裝好。

(6)使用結(jié)束關(guān)閉所有電源并做好使用記錄。

(7)如需詳細(xì)說(shuō)明,請(qǐng)借閱說(shuō)明書(shū)。

 

 

操作流程(SABC- FITC)三步發(fā)光法

細(xì)胞爬片

蓋玻片的處理:先用洗潔精沖洗干凈(用大號(hào)的培養(yǎng)皿,將玻片平鋪在上面,把洗潔精弄出泡泡,放在水平搖床上搖30min~60min)→用自來(lái)水沖洗干凈(先放在水上沖,再加上自來(lái)水在搖床上搖約30min×3次)→將濃硫酸加入培養(yǎng)皿中,泡酸24 h→自來(lái)水沖洗干凈→ddH2O沖洗30~50min×3次→放入60℃烤箱烤干→用紗布將玻片平攤開(kāi)來(lái),隔層包裹→置于飯盒中高溫高壓消毒

細(xì)胞長(zhǎng)滿,0.25%胰酶消化,細(xì)胞計(jì)數(shù),接種至6孔板,每孔約3ml細(xì)胞懸液,加完后在邊上輕輕吹幾下,十字形晃動(dòng)數(shù)次,保證細(xì)胞在蓋玻片上均勻覆蓋。(注意:1、預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí),摸一個(gè)的細(xì)胞量,一般3~5×105為宜;2、先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基,目的是使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,然后放玻片,防止加細(xì)胞懸液時(shí)玻片漂起,造成雙層細(xì)胞貼片。3、整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作。)

培養(yǎng)24h,待細(xì)胞接近60%~70%匯合

取出六孔板,浸入0.01MPBS,約3ml/孔,于搖床上搖5min×3次

固定:

4%多聚甲醛固定30min(室溫),約2ml/孔

棄干凈液體,(用吸管在邊緣處輕輕吹打幾次)浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次

破膜:

加0.1%TritonX-100,20min,室溫,約2ml/孔

棄干凈液體,(用吸管在邊緣處輕輕吹打幾次)浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次

消除非特異性反應(yīng):

浸入0.75%H2O2,在37℃作用30min(配方:1ml30%H2O2+39ml 0.01M PBS,現(xiàn)用現(xiàn)配,避光保存)

棄干凈液體,浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次

以下操作均在濕盒中進(jìn)行

封閉:

滴加用0.01M PBS1:10稀釋的正常血清封閉液,37℃,30min(注意:150ul/孔;吸去多余的液體,不要洗)

免疫反應(yīng):

滴加0.01M PBS按一定比例稀釋的一抗,150ul/孔(稀釋度,一般取推薦濃度的中間值),37℃,30min后,4℃過(guò)夜

復(fù)溫,室溫放置30~45min,(用or不用37℃放置10~20 min)【一抗孵育,總時(shí)長(zhǎng)在16~18h

棄干凈液體,浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次

滴加0.01M PBS 1:100稀釋的生物素化二抗,150ul/孔,37℃,30min

棄干凈液體,浸入0.01MPBS于搖床上搖5min×3次

發(fā)光:(此操作一定要避光,可以將搖床拿入暗室當(dāng)中,)

滴加0.01M PBS 1:100稀釋的SABC-FITC,150ul/孔,37℃,30min

棄干凈液體,浸入0.01MPBS,5min×3~4次(一定要洗干凈,否則背景會(huì)很高)

取玻片時(shí)由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,張力較大,將注射器針頭針尖向背面弄個(gè)小鉤,這樣將爬片輕輕勾起,用小鑷子取出就可以了

緩沖甘油封片,熒光顯微鏡觀察

 

注意事項(xiàng):

1、在六孔板間隙的孔中加入0.01M PBS,制成濕盒環(huán)境。

2、需設(shè)空白對(duì)照。從加一抗開(kāi)始,空白對(duì)照組全部用0.01M PBS。

3、熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,或于4℃保存4h,時(shí)間過(guò)長(zhǎng) ,會(huì)使熒光減弱。

4、需在操作的各個(gè)步驟中,始終保持濕潤(rùn),避免干燥。

5、所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物,應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色。

 

試劑配制:

1、0.01M PBS       1000ml            2000ml         5000ml

   NaCl             8.5g             17.0g          42.5g

   NaH2PO4.2H2O      0.3g               0.6g           1.5g

  Na2HPO4.12H2O      2.9g               5.8g          14.5g

 

2、0.1%TritonX-100

   TritonX-100       100ul   定容至    常溫保存?zhèn)溆?/span>

   0.01M PBS         100ml   100ml

 

 

3、4%多聚甲醛

   多聚甲醛         4g         60℃約5min+2滴2mol/L    搖晃 ,定容至100ml

   0.01M PBS        100ml         NaOH助溶 PH=7.2       4℃保存,2周用完

 

4、0.75% H2O2

    30% H2O2             1ml                現(xiàn)用現(xiàn)配,

  0.01M PBS        39ml               4℃避光保存

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